重复经颅磁刺激是一种无创的脑刺激技术，作为一种治疗性神经康复手段备受关注。已有研究表明，高频重复经颅磁刺激可以提高动物在行为测试中的认知能力和神经元兴奋性。本文旨在研究小鼠自然老化过程中，高频重复经颅磁刺激对其认知能力和神经兴奋性的影响。实验采用青年小鼠、成年小鼠、老年小鼠各 12 只，且每个年龄段小鼠被随机分成刺激组和对照组。刺激组小鼠接受连续 15 天的高频重复经颅磁刺激，对照组接受连续 15 天的伪刺激。刺激结束之后，进行新物体识别与跳台测试，用以检查小鼠的学习记忆能力。行为学测试结束之后，进行全细胞脑片膜片钳实验，用以记录并分析海马齿状回颗粒神经元的静息膜电位、动作电位及其相关电特性指标。数据分析表明，小鼠认知能力与神经兴奋性随着老化而显著衰退，高频重复经颅磁刺激能显著改善认知损伤并缓解神经电特性指标的衰退。通过改变海马齿状回颗粒神经元电生理特性以及提高神经元兴奋性，可能是重复经颅磁刺激缓解认知损伤、提高认知能力的机制之一。
引用本文： 朱海军, 丁冲, 李洋, 徐桂芝. 重复经颅磁刺激显著改善小鼠老化过程中认知损伤及提高神经元兴奋性. 生物医学工程学杂志, 2020, 37(3): 380-388. doi: 10.7507/1001-5515.201905072 复制
引言
重复经颅磁刺激是一种应用在认知与神经科学领域的非侵入性、无创的大脑刺激与调控技术[1-2]。重复经颅磁刺激技术是利用电磁感应的原理，通过刺激线圈产生快速变化的脉冲磁场，在大脑皮层中诱导产生变化的磁场[3-4]。作为一种科研技术和临床治疗手段，重复经颅磁刺激早已广泛地应用在基础神经科学和神经疾病领域之中，在阿尔茨海默病、帕金森病、抑郁症、精神分裂症等研究中发挥了积极的作用[5-11]。
已有研究结果的一般规律表明，低频重复经颅磁刺激在大脑中产生抑制作用，而高频重复经颅磁刺激在大脑中产生兴奋作用[2-3]。大量文献报道，重复经颅磁刺激可以重塑神经连接和诱导神经可塑性[12-16]，以及提高神经元兴奋性和改善认知功能等[5, 17-19]。但经颅磁刺激的具体作用机制尚不明确。
海马脑区是大脑中参与学习记忆过程、调节认知功能的重要组成部分[20]，海马齿状回在空间行为中起着至关重要的作用[21]。本文的主要目的是研究在昆明小鼠大脑自然老化过程中，高频重复经颅磁刺激对其认知功能与神经兴奋性的影响。本研究提出假设：大脑老化过程中学习记忆功能的衰退与海马齿状回颗粒神经元兴奋性的衰退有关，通过改善齿状回颗粒神经元电生理特性、增加神经兴奋性从而缓解认知损伤，是重复经颅磁刺激提高认知能力的潜在作用机制之一。
1 材料与方法
1.1 实验设计
研究采用不同年龄段昆明小鼠，每个年龄段小鼠按照是否接受刺激分为实验组与对照组。刺激或伪刺激结束后进行动物行为学测试，包括新物体识别与小鼠跳台实验。行为学测试结束后进行脑片膜片钳电生理实验。具体实验流程及时间安排如图 1 所示。
图1
实验设计流程图
Figure1.
Experimental design
1.2 实验动物及分组
所有动物实验均获得河北工业大学与华北理工大学伦理委员会批准，且符合实验动物使用规范（实验动物许可证号：SYXK（冀）2015-0038；伦理审查编号：LX201886）。实验所需的青年小鼠（2 月龄）、成年小鼠（9 月龄）、老年小鼠（14 月龄）各 12 只，购买自北京华阜康生物科技有限公司。饲养小鼠的实验环境温度维持在（25 ± 1）℃，湿度维持在 50%～60%，给予小鼠充足的食物与水，12 小时光照与黑暗交替循环。每个年龄段的小鼠被随机分成两组，即刺激组与对照组。
1.3 重复经颅磁刺激
实验采用英国 Magstim 公司生产的 Rapid2刺激器及型号为 D70 P/N9925-00 的标准八字型线圈。在给刺激组小鼠施加刺激的过程中，线圈的放置方法及线圈与小鼠头部的位置关系参照相关文献报道[18]。刺激组的实验参数采用高频 20 Hz，刺激强度约为 0.3 T（系线圈最大输出强度的 15%，线圈最大输出强度为 2.2 T），每天 1 000 个脉冲刺激，连续进行 15 天。对照组小鼠接受伪刺激，将线圈翻转垂直于小鼠头部且离开一段距离，小鼠只能听到刺激声音而不接受刺激。刺激在每天上午 8:00～10:00 进行。
1.4 新物体识别
本研究进行的新物体识别测试在参考相关文献[22-23]的基础上，一共分为四个阶段，即适应期、训练期、测试Ⅰ期与测试Ⅱ期。在适应期，每只小鼠被单独放入空置的新物体识别箱体中自由活动 20 min。适应期结束 24 h 后进行训练期测试，两个相同的物体被平行且靠近箱体一侧放置在箱体底部，每只小鼠被单独放入箱体中自由探索 10 min。训练期结束 1 h 后进行测试Ⅰ期的实验，其中一个物体被一个形状颜色不一但尺寸相当的新物体替代，每只小鼠被单独放入箱体中自由探索 5 min，并用摄像机跟踪记录。测试Ⅰ期结束的 24 h 之后进行测试Ⅱ期的实验，另一个旧物体被另一个形状颜色不一但尺寸相当的新物体替代，每只小鼠被单独放入箱体中自由探索 5 min，并用摄像机跟踪记录。在不同的实验阶段和每两只小鼠任务之间，箱体与物体都要用 70% 的酒精擦拭，避免动物遗留气味对自由探索行为造成干扰。新物体识别实验设计流程见图 2。
图2
新物体识别实验流程图
Figure2.
Experimental protocol of novel object recognition test
测试Ⅰ期与测试Ⅱ期的小鼠行为被跟踪记录，并据此单独分析每只小鼠探索新物体的时间和 T1 与探索旧物体的时间和 T2，计算得到测试Ⅰ期与测试Ⅱ期的认知指数 CI(1 h) 与 CI(24 h)。认知指数计算公式为 CI = T1/(T1 + T2)。
1.5 小鼠跳台
跳台实验采用中国成都泰盟公司的 8 通道跳台分析实验系统，包括主机、刺激器、跳台箱体。跳台箱体由 8 个独立的通道组成，每个通道尺寸 140 mm × 155 mm × 300 mm，每个通道内置一个圆柱形绝缘跳台（直径 45 mm，高 45 mm），箱体底部平行铺有 24 根铜棒组成的铜栅。跳台实验分为三个阶段，即适应期、电刺激期、被动逃避期。在适应期，每只小鼠被面对箱体壁放在跳台之上，记录小鼠第一次跳下台子的时间作为跳台潜伏期。适应期结束 24 h 后进行电刺激期的测试，每只小鼠被单独放置在箱体底部的铜栅之上，并在铜栅上施加 28 V 直流电刺激。当小鼠由于躲避足底电击跳上台子之后开始计时，记录 5 min 内小鼠跳下台子受到电击的犯错误次数以及 5 min 内小鼠在跳台上的停留时间百分比。电刺激期结束 24 h 后进行被动逃避期的测试，每只小鼠被面对箱体壁放在跳台之上，记录小鼠第一次跳下台子的时间作为被动逃避潜伏期。在不同的实验阶段和每两只小鼠任务之间，箱体与台子都要用 70% 的酒精擦拭，避免遗留气味对小鼠行为造成干扰。跳台实验设计流程见图 3。
图3
跳台实验流程图
Figure3.
Experimental protocol of step-down test
1.6 全细胞脑片膜片钳
小鼠在麻醉状态下被迅速断头取脑，大脑浸入冰水混合状态且氧饱和的切片液中。使用德国徕卡 VT1200S 型号的震动切片机将大脑切成 300 μm 厚度的脑片，并将脑片移入氧饱和的 32 ℃ 恒温人工脑脊液中孵育 1 h。取孵育完成的脑片置于膜片钳平台上的脑片记录槽中，安装上充灌有电极内液的玻璃微电极，在正置显微镜下进行封接破膜与信号记录。切片液、人工脑脊液与电极内液的成分见表 1。
表1
切片液、人工脑脊液与电极内液离子成分
Table1.
The ionic composition of cutting solution, artificial cerebrospinal fluid and internal solutions
实验选取海马齿状回颗粒神经元作为目标细胞。采用全细胞电流钳记录模式，记录颗粒神经元的静息膜电位、200 pA 刺激 500 ms 时长的长时程去极化电流下的动作电位放电个数，以及 200 pA 去极化电流下的单个诱发动作电位。分析了单个诱发动作电位的后超极化电位幅度、动作电位峰值、动作电位达峰时间、动作电位上升支与下降支平均斜率。动作电位相关指标分析如图 4 所示。
图4
动作电位相关指标示意图
Figure4.
Schematic diagram of related indexes of action potential
1.7 数据及统计分析
数据分析采用 Two-way ANOVA 分析方法，年龄与治疗方式（有无磁刺激）作为两个主因素。事后分析即组别之间的多重比较采用 Bonferroni-test 矫正下的成对 t 检验分析方法。统计结果以均数 ± 标准差的方式呈现，检验水准为 0.05。
2 数据分析结果
2.1 新物体识别
如图 5a 所示，对测试Ⅰ期认知指数的分析表明，年龄（F(2, 30) = 8.858，P < 0.001）与治疗方式（F(1, 30) = 10.73，P < 0.01）均表现出了显著的主因素效应，且年龄与治疗方式表现出了显著的交互效应（F(2, 30) = 7.536，P < 0.01）。事后分析结果表明，老年对照组的测试Ⅰ期认知指数显著低于青年对照组与成年对照组，老年刺激组的测试Ⅰ期认知指数显著高于老年对照组。
图5
新物体识别认知指数
a. 测试Ⅰ期认知指数；b.测试Ⅱ期认知指数。**
a. cognitive index of test Ⅰ phase; b. cognitive index of test Ⅱ phase. **
如图 5b 所示，对测试Ⅱ期认知指数的分析表明，年龄（F(2, 30) = 0.951 8，P = 0.3974）没有表现出显著的主因素效应，治疗方式（F(1, 30) = 4.267，P < 0.05）表现出了显著的主因素效应，年龄与治疗方式表现出了显著的交互效应（F(2, 30) = 24.34，P < 0.001）。事后分析结果表明，老年刺激组的测试Ⅱ期认知指数显著高于老年对照组。
新物体识别数据分析的结果表明，小鼠在大脑自然老化的过程中，其与空间记忆相关的认知能力是逐渐衰退的，高频重复经颅磁刺激可以显著改善年龄老化引起的认知能力的损伤。从对照组测试Ⅰ期与Ⅱ期认知指数的整体分布来看，Ⅰ期认知指数明显高于Ⅱ期认知指数，或可暗示小鼠在空间记忆相关的行为任务中短期记忆能力比长期记忆能力更强。
2.2 小鼠跳台
如图 6a 所示，对跳台潜伏期的分析表明，年龄（F(2, 30) = 1.207，P = 0.313 1）与治疗方式（F(1, 30) = 0.107 8，P = 0.745 0）均没有表现出显著的主因素效应，也没有表现出主因素之间显著的交互效应（F(2, 30) = 0.016 1，P = 0.984 0）。
图6
跳台实验数据分析
a. 潜伏期；b. 犯错误次数；c. 跳台停留时间百分比；d. 被动逃避潜伏期。**
a. step-down latency; b. number of mistakes; c. percentage of residence time on the platform; d. passive escape latency. **
如图 6b 所示，对犯错误次数的分析表明，年龄（F(2, 30) = 0.221 5，P = 0.802 6）没有表现出显著的主因素效应，治疗方式（F(1, 30) = 15.32，P < 0.001）有显著的主因素效应，且主因素之间表现出了显著的交互效应（F(2, 30) = 4.209，P < 0.05）。事后分析结果表明，老年刺激组的犯错误次数显著低于老年对照组。
如图 6c 所示，对跳台停留时间百分比的分析表明，年龄（F(2, 30) = 9.672，P < 0.001）与治疗方式（F(1, 30) = 4.396，P < 0.05）表现出了显著的主因素效应，主因素之间表现出了显著的交互效应（F(2, 30) = 16.47，P < 0.001）。事后分析结果表明，老年对照组的跳台停留时间百分比显著低于青年对照组和成年对照组，老年刺激组的跳台停留时间百分比显著高于老年对照组。
如图 6d 所示，对被动逃避潜伏期的分析表明，年龄（F(2, 30) = 9.126，P < 0.001）与治疗方式（F(1, 30) = 7.945，P < 0.01）表现出了显著的主因素效应，主因素之间表现出了显著的交互效应（F(2, 30) = 9.234，P < 0.001）。事后分析结果表明，老年对照组的被动逃避潜伏期显著低于青年对照组和成年对照组，老年刺激组的被动逃避潜伏期显著高于老年对照组。
不同于新物体识别用于检测空间学习记忆能力，跳台实验属于被动逃避条件反射，主要反映动物非空间学习记忆能力的改变。在经历电击之前的适应期训练中，潜伏期没有明显变化，说明磁刺激并未显著影响小鼠的运动能力。犯错误次数是小鼠被电击的次数，反映了短期学习记忆能力，对照组没有表现出显著的差异，表明小鼠的非空间短期学习记忆能力在老化过程中未受到显著影响。在这个过程中老年小鼠的跳台停留时间百分比明显降低，说明老年小鼠从受到电击到再次回到圆台之间的时间间隔较长。被动逃避潜伏期反映小鼠长期学习记忆能力，由于小鼠对足底电击形成了恐惧记忆，所以在被动逃避潜伏期的测试中小鼠并没有很快跳下圆台，且对照组中老年小鼠的被动逃避潜伏期显著降低，表明小鼠在老化过程中的非空间长期学习记忆能力有所减退。在高频重复经颅磁刺激的神经调控作用之下，小鼠的非空间学习记忆能力均得到了明显改善。
2.3 脑片膜片钳
如图 7a 所示，对静息膜电位的分析表明，年龄（F(2, 30) = 3.854，P < 0.05）与治疗方式（F(1, 30) = 22.04，P < 0.001）均表现出了显著的主因素效应，主因素间表现出了显著的交互效应（F(2, 30) = 26.69，P < 0.001）。事后分析结果表明，老年对照组的静息膜电位显著低于青年对照组和成年对照组，老年刺激组的静息膜电位显著高于老年对照组。
图7
膜电位及动作电位相关电特性数据分析
a. 静息膜电位；b. 动作电位发放个数；c. 后超极化电位；d. 动作电位峰值；e. 动作电位达峰时间；f. 动作电位上升支平均斜率；g. 动作电位下降支平均斜率。*
a. resting membrane potential; b. the number of APs released; c. after-hyperpolarizing potential; d. AP peak amplitude; e. time to AP peak amplitude; f. average rise slope of AP; g. average down slope of AP. *
如图 7b 所示，对动作电位个数的分析表明，年龄（F(2, 30) = 13.62，P < 0.001）与治疗方式（F(1, 30) = 16.25，P < 0.001）均表现出了显著的主因素效应，主因素间表现出了显著的交互效应（F(2, 30) = 5.027，P < 0.05）。事后分析结果表明，老年对照组的动作电位个数显著少于青年对照组和成年对照组，老年刺激组的动作电位个数显著多于老年对照组。
如图 7c 所示，对后超极化电位的分析表明，年龄（F(2, 30) = 5.806，P < 0.01）与治疗方式（F(1, 30) = 9.13，P < 0.01）均表现出了显著的主因素效应，主因素间表现出了显著的交互效应（F(2, 30) = 5.197，P < 0.05）。事后分析结果表明，老年对照组的后超极化电位显著低于青年对照组，老年刺激组的后超极化电位显著高于老年对照组。
如图 7d 所示，对动作电位峰值的分析表明，年龄（F(2, 30) = 0.077，P = 0.926）与治疗方式（F(1, 30) = 0.076，P = 0.784）均没有表现出显著的主因素效应，也没有表现出主因素之间显著的交互效应（F(2, 30) = 0.611，P = 0.549）。
如图 7e 所示，对动作电位达峰时间的分析表明，年龄（F(2, 30) = 4.985，P < 0.05）与治疗方式（F(1, 30) = 9.685，P < 0.01）均表现出了显著的主因素效应，主因素间表现出了显著的交互效应（F(2, 30) = 5.212，P < 0.05）。事后分析结果表明，老年对照组的达峰时间显著长于青年对照组和成年对照组，老年刺激组的达峰时间显著少于老年对照组。
如图 7f 所示，对动作电位上升支平均斜率的分析表明，年龄（F(2，30)= 12.67，P < 0.001）与治疗方式（F(1, 30) = 4.251，P < 0.05）表现出了显著的主因素效应，主因素之间表现出了显著的交互效应（F(2, 30) = 8.008，P < 0.01）。事后分析结果表明，老年对照组的上升支平均斜率显著低于青年对照组和成年对照组，老年刺激组的上升支平均斜率显著高于老年对照组。
如图 7g 所示，对动作电位下降支平均斜率的分析表明，年龄（F(2, 30) = 20.69，P < 0.001）与治疗方式（F(1, 30) = 5.407，P < 0.05）表现出了显著的主因素效应，主因素之间表现出了显著的交互效应（F(2, 30) = 11.06，P < 0.001）。事后分析结果表明，老年对照组下降支平均斜率的绝对值显著低于青年对照组和成年对照组，老年刺激组的下降支平均斜率的绝对值显著高于老年对照组。
通过对膜电位及动作电位相关数据的分析可得出，几乎所有的指标在整体上都呈现出相似的变化趋势，即随着自然老化过程的发生，神经兴奋性相关指标逐渐衰退，且在高频重复经颅磁刺激的调控下有所改善，特别是对老年个体相关指标的提高尤为显著。从具体特征分析来看，老年小鼠的静息膜电位相比于青年成年小鼠显著超极化，后超极化电位幅度显著增加，暗示老年小鼠神经元在静息状态下的神经兴奋性更低，在相同的刺激下使其去极化产生神经放电更难。同样地，老年小鼠神经元的后超极化电位幅度显著增加，使其神经元放电后回到了一个更低的兴奋性水平，其再次兴奋产生神经放电的能力相对更弱。动作电位达峰时间（从刺激起点至达到峰值的时间）与经线性拟合得到的上升支平均斜率的变化趋势是一致的，时间越短说明相关离子通道的开闭速率越快，膜电位去极化的过程越迅速，上升支斜率越大。下降支斜率越大，说明复极化的过程越迅速。由此在相同的时间内，神经元的放电频率越高。
3 讨论
本文旨在探究在自然老化过程中，重复经颅磁刺激对昆明小鼠认知能力与神经兴奋性的影响，并且提出了假设：老化引起的学习记忆功能的衰退可能与海马齿状回颗粒神经元相关电特性的衰退有关，如静息膜电位、后超极化电位、动作电位放电频数、动作电位峰值等，且重复经颅磁刺激可能是通过改善海马齿状回神经兴奋性从而改善认知能力。实验结果表明，昆明小鼠在老化过程中，伴随着认知功能与齿状回颗粒神经元相关电特性的退化，重复经颅磁刺激能显著改善老年小鼠的这一退化现象，但对健康的青年与成年个体影响较小。这些结果与相关文献的论述亦不冲突[24]。
基于啮齿类动物对新事物自主探索的天性，新物体识别测试被用来获取与空间记忆相关的信息[25]。这种类型的测试可以用来研究海马在空间和工作记忆水平甚至是在认知形成过程中的功能[26]。本研究进行了短期与长期的学习记忆和空间探索能力的测试，结果显示老化伴随认知衰退，而高频重复经颅磁刺激可以显著缓解老年小鼠的这一认知损伤。已有相关研究表明，高频重复经颅磁刺激可以显著提高睡眠剥夺八齿鼠在新物体识别任务中的认知指数与空间记忆[25]。从实验设计的改进方面考虑，新的空间位置的识别在这一任务中是很重要的[25]，通过接触两个物体的总时间来分析动物的运动能力也是必要的[27]。
基于被动逃避潜伏期的测量，发展了跳台的测试方法用以分析小鼠的学习记忆能力[28]，且跳台测试现已被应用于神经退行性疾病（如健忘症）中认知能力的研究[29]。本研究的结果显示：老化伴随认知衰退，高频重复经颅磁刺激可以显著缓解老年小鼠的这一认知损伤；在小鼠没有接受足底电刺激之前，跳台潜伏期没有显著差异，说明本研究采用的高频重复经颅磁刺激并未对小鼠的运动能力造成影响；对照组小鼠犯错误次数逐渐增多的趋势与跳台停留时间百分比显著降低的趋势相辅相成。有研究报道高频重复经颅磁刺激可以显著提高老年昆明小鼠在跳台被动逃避任务中的表现[30]，这与本研究的结果高度吻合。
在对动作电位相关电特性指标的分析中，磁刺激的作用可以显著缩短老年刺激小鼠动作电位达到峰值的时间，并且显著提高动作电位上升支/下降支的平均斜率，可以推测老化降低了神经元离子通道的活性，而磁刺激的作用使得离子通道的开放与关闭更加活跃。已有文献报道[17]，老年小鼠的静息膜电位相比于成年小鼠显著超极化，动作电位放电频率显著降低，后超极化电位幅度显著增加，25 Hz 的高频重复经颅磁刺激可以显著提高老年小鼠的这些神经兴奋性指标，这些发现与本研究结果高度相似。
高频重复经颅磁刺激是一种间接非侵入性的无创脑刺激技术，通过线圈产生磁场穿透颅骨，进而诱导大脑神经兴奋性产生变化[3]。在我们的研究中采用了标准的“8”字型线圈，其尺寸大于小鼠头部。因现有技术的局限性，目前无法做到对小鼠特定脑区的单一精准刺激，因此这种刺激方式是一种全脑刺激。在全脑刺激的前提下，我们研究了海马齿状回颗粒神经元兴奋性的变化，实验结果分析证明这种刺激方式是有效的。通过对比其他人员的研究，类似的全脑刺激模式是普遍被采用的[17-18, 31]，因此通过我们采用的刺激方式得到的实验结果是可靠的。虽然高频重复经颅磁刺激在本研究中显示出了积极的作用，但是本研究采用的参数设置并不能盲目应用于临床治疗。到目前为止，关于磁刺激的科学研究与临床应用，尚无统一制定的参数标准，其治疗效果也并不稳定。因此，继续探索磁刺激作用的神经机制，持续优化刺激方案，仍然是探究重复经颅磁刺激在改善认知功能方面的研究重点。
4 结论
自然老化引起的昆明小鼠认知能力的衰退与海马齿状回颗粒神经元相关电特性的衰退有关，高频重复经颅磁刺激可以缓解认知损伤与神经元相关电特性的衰退，在老年个体中的缓解作用尤为显著。通过改变海马齿状回颗粒神经元电生理特性以及提高神经元兴奋性，可能是重复经颅磁刺激缓解认知损伤、提高认知能力的机制之一。
利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。
引言
重复经颅磁刺激是一种应用在认知与神经科学领域的非侵入性、无创的大脑刺激与调控技术[1-2]。重复经颅磁刺激技术是利用电磁感应的原理，通过刺激线圈产生快速变化的脉冲磁场，在大脑皮层中诱导产生变化的磁场[3-4]。作为一种科研技术和临床治疗手段，重复经颅磁刺激早已广泛地应用在基础神经科学和神经疾病领域之中，在阿尔茨海默病、帕金森病、抑郁症、精神分裂症等研究中发挥了积极的作用[5-11]。
已有研究结果的一般规律表明，低频重复经颅磁刺激在大脑中产生抑制作用，而高频重复经颅磁刺激在大脑中产生兴奋作用[2-3]。大量文献报道，重复经颅磁刺激可以重塑神经连接和诱导神经可塑性[12-16]，以及提高神经元兴奋性和改善认知功能等[5, 17-19]。但经颅磁刺激的具体作用机制尚不明确。
海马脑区是大脑中参与学习记忆过程、调节认知功能的重要组成部分[20]，海马齿状回在空间行为中起着至关重要的作用[21]。本文的主要目的是研究在昆明小鼠大脑自然老化过程中，高频重复经颅磁刺激对其认知功能与神经兴奋性的影响。本研究提出假设：大脑老化过程中学习记忆功能的衰退与海马齿状回颗粒神经元兴奋性的衰退有关，通过改善齿状回颗粒神经元电生理特性、增加神经兴奋性从而缓解认知损伤，是重复经颅磁刺激提高认知能力的潜在作用机制之一。
1 材料与方法
1.1 实验设计
研究采用不同年龄段昆明小鼠，每个年龄段小鼠按照是否接受刺激分为实验组与对照组。刺激或伪刺激结束后进行动物行为学测试，包括新物体识别与小鼠跳台实验。行为学测试结束后进行脑片膜片钳电生理实验。具体实验流程及时间安排如图 1 所示。
图1
实验设计流程图
Figure1.
Experimental design
1.2 实验动物及分组
所有动物实验均获得河北工业大学与华北理工大学伦理委员会批准，且符合实验动物使用规范（实验动物许可证号：SYXK（冀）2015-0038；伦理审查编号：LX201886）。实验所需的青年小鼠（2 月龄）、成年小鼠（9 月龄）、老年小鼠（14 月龄）各 12 只，购买自北京华阜康生物科技有限公司。饲养小鼠的实验环境温度维持在（25 ± 1）℃，湿度维持在 50%～60%，给予小鼠充足的食物与水，12 小时光照与黑暗交替循环。每个年龄段的小鼠被随机分成两组，即刺激组与对照组。
1.3 重复经颅磁刺激
实验采用英国 Magstim 公司生产的 Rapid2刺激器及型号为 D70 P/N9925-00 的标准八字型线圈。在给刺激组小鼠施加刺激的过程中，线圈的放置方法及线圈与小鼠头部的位置关系参照相关文献报道[18]。刺激组的实验参数采用高频 20 Hz，刺激强度约为 0.3 T（系线圈最大输出强度的 15%，线圈最大输出强度为 2.2 T），每天 1 000 个脉冲刺激，连续进行 15 天。对照组小鼠接受伪刺激，将线圈翻转垂直于小鼠头部且离开一段距离，小鼠只能听到刺激声音而不接受刺激。刺激在每天上午 8:00～10:00 进行。
1.4 新物体识别
本研究进行的新物体识别测试在参考相关文献[22-23]的基础上，一共分为四个阶段，即适应期、训练期、测试Ⅰ期与测试Ⅱ期。在适应期，每只小鼠被单独放入空置的新物体识别箱体中自由活动 20 min。适应期结束 24 h 后进行训练期测试，两个相同的物体被平行且靠近箱体一侧放置在箱体底部，每只小鼠被单独放入箱体中自由探索 10 min。训练期结束 1 h 后进行测试Ⅰ期的实验，其中一个物体被一个形状颜色不一但尺寸相当的新物体替代，每只小鼠被单独放入箱体中自由探索 5 min，并用摄像机跟踪记录。测试Ⅰ期结束的 24 h 之后进行测试Ⅱ期的实验，另一个旧物体被另一个形状颜色不一但尺寸相当的新物体替代，每只小鼠被单独放入箱体中自由探索 5 min，并用摄像机跟踪记录。在不同的实验阶段和每两只小鼠任务之间，箱体与物体都要用 70% 的酒精擦拭，避免动物遗留气味对自由探索行为造成干扰。新物体识别实验设计流程见图 2。
图2
新物体识别实验流程图
Figure2.
Experimental protocol of novel object recognition test
测试Ⅰ期与测试Ⅱ期的小鼠行为被跟踪记录，并据此单独分析每只小鼠探索新物体的时间和 T1 与探索旧物体的时间和 T2，计算得到测试Ⅰ期与测试Ⅱ期的认知指数 CI(1 h) 与 CI(24 h)。认知指数计算公式为 CI = T1/(T1 + T2)。
1.5 小鼠跳台
跳台实验采用中国成都泰盟公司的 8 通道跳台分析实验系统，包括主机、刺激器、跳台箱体。跳台箱体由 8 个独立的通道组成，每个通道尺寸 140 mm × 155 mm × 300 mm，每个通道内置一个圆柱形绝缘跳台（直径 45 mm，高 45 mm），箱体底部平行铺有 24 根铜棒组成的铜栅。跳台实验分为三个阶段，即适应期、电刺激期、被动逃避期。在适应期，每只小鼠被面对箱体壁放在跳台之上，记录小鼠第一次跳下台子的时间作为跳台潜伏期。适应期结束 24 h 后进行电刺激期的测试，每只小鼠被单独放置在箱体底部的铜栅之上，并在铜栅上施加 28 V 直流电刺激。当小鼠由于躲避足底电击跳上台子之后开始计时，记录 5 min 内小鼠跳下台子受到电击的犯错误次数以及 5 min 内小鼠在跳台上的停留时间百分比。电刺激期结束 24 h 后进行被动逃避期的测试，每只小鼠被面对箱体壁放在跳台之上，记录小鼠第一次跳下台子的时间作为被动逃避潜伏期。在不同的实验阶段和每两只小鼠任务之间，箱体与台子都要用 70% 的酒精擦拭，避免遗留气味对小鼠行为造成干扰。跳台实验设计流程见图 3。
图3
跳台实验流程图
Figure3.
Experimental protocol of step-down test
1.6 全细胞脑片膜片钳
小鼠在麻醉状态下被迅速断头取脑，大脑浸入冰水混合状态且氧饱和的切片液中。使用德国徕卡 VT1200S 型号的震动切片机将大脑切成 300 μm 厚度的脑片，并将脑片移入氧饱和的 32 ℃ 恒温人工脑脊液中孵育 1 h。取孵育完成的脑片置于膜片钳平台上的脑片记录槽中，安装上充灌有电极内液的玻璃微电极，在正置显微镜下进行封接破膜与信号记录。切片液、人工脑脊液与电极内液的成分见表 1。
表1
切片液、人工脑脊液与电极内液离子成分
Table1.
The ionic composition of cutting solution, artificial cerebrospinal fluid and internal solutions
实验选取海马齿状回颗粒神经元作为目标细胞。采用全细胞电流钳记录模式，记录颗粒神经元的静息膜电位、200 pA 刺激 500 ms 时长的长时程去极化电流下的动作电位放电个数，以及 200 pA 去极化电流下的单个诱发动作电位。分析了单个诱发动作电位的后超极化电位幅度、动作电位峰值、动作电位达峰时间、动作电位上升支与下降支平均斜率。动作电位相关指标分析如图 4 所示。
图4
动作电位相关指标示意图
Figure4.
Schematic diagram of related indexes of action potential
1.7 数据及统计分析
数据分析采用 Two-way ANOVA 分析方法，年龄与治疗方式（有无磁刺激）作为两个主因素。事后分析即组别之间的多重比较采用 Bonferroni-test 矫正下的成对 t 检验分析方法。统计结果以均数 ± 标准差的方式呈现，检验水准为 0.05。
2 数据分析结果
2.1 新物体识别
如图 5a 所示，对测试Ⅰ期认知指数的分析表明，年龄（F(2, 30) = 8.858，P < 0.001）与治疗方式（F(1, 30) = 10.73，P < 0.01）均表现出了显著的主因素效应，且年龄与治疗方式表现出了显著的交互效应（F(2, 30) = 7.536，P < 0.01）。事后分析结果表明，老年对照组的测试Ⅰ期认知指数显著低于青年对照组与成年对照组，老年刺激组的测试Ⅰ期认知指数显著高于老年对照组。
图5
新物体识别认知指数
a. 测试Ⅰ期认知指数；b.测试Ⅱ期认知指数。**
a. cognitive index of test Ⅰ phase; b. cognitive index of test Ⅱ phase. **
如图 5b 所示，对测试Ⅱ期认知指数的分析表明，年龄（F(2, 30) = 0.951 8，P = 0.3974）没有表现出显著的主因素效应，治疗方式（F(1, 30) = 4.267，P < 0.05）表现出了显著的主因素效应，年龄与治疗方式表现出了显著的交互效应（F(2, 30) = 24.34，P < 0.001）。事后分析结果表明，老年刺激组的测试Ⅱ期认知指数显著高于老年对照组。
新物体识别数据分析的结果表明，小鼠在大脑自然老化的过程中，其与空间记忆相关的认知能力是逐渐衰退的，高频重复经颅磁刺激可以显著改善年龄老化引起的认知能力的损伤。从对照组测试Ⅰ期与Ⅱ期认知指数的整体分布来看，Ⅰ期认知指数明显高于Ⅱ期认知指数，或可暗示小鼠在空间记忆相关的行为任务中短期记忆能力比长期记忆能力更强。
2.2 小鼠跳台
如图 6a 所示，对跳台潜伏期的分析表明，年龄（F(2, 30) = 1.207，P = 0.313 1）与治疗方式（F(1, 30) = 0.107 8，P = 0.745 0）均没有表现出显著的主因素效应，也没有表现出主因素之间显著的交互效应（F(2, 30) = 0.016 1，P = 0.984 0）。
图6
跳台实验数据分析
a. 潜伏期；b. 犯错误次数；c. 跳台停留时间百分比；d. 被动逃避潜伏期。**
a. step-down latency; b. number of mistakes; c. percentage of residence time on the platform; d. passive escape latency. **
如图 6b 所示，对犯错误次数的分析表明，年龄（F(2, 30) = 0.221 5，P = 0.802 6）没有表现出显著的主因素效应，治疗方式（F(1, 30) = 15.32，P < 0.001）有显著的主因素效应，且主因素之间表现出了显著的交互效应（F(2, 30) = 4.209，P < 0.05）。事后分析结果表明，老年刺激组的犯错误次数显著低于老年对照组。
如图 6c 所示，对跳台停留时间百分比的分析表明，年龄（F(2, 30) = 9.672，P < 0.001）与治疗方式（F(1, 30) = 4.396，P < 0.05）表现出了显著的主因素效应，主因素之间表现出了显著的交互效应（F(2, 30) = 16.47，P < 0.001）。事后分析结果表明，老年对照组的跳台停留时间百分比显著低于青年对照组和成年对照组，老年刺激组的跳台停留时间百分比显著高于老年对照组。
如图 6d 所示，对被动逃避潜伏期的分析表明，年龄（F(2, 30) = 9.126，P < 0.001）与治疗方式（F(1, 30) = 7.945，P < 0.01）表现出了显著的主因素效应，主因素之间表现出了显著的交互效应（F(2, 30) = 9.234，P < 0.001）。事后分析结果表明，老年对照组的被动逃避潜伏期显著低于青年对照组和成年对照组，老年刺激组的被动逃避潜伏期显著高于老年对照组。
不同于新物体识别用于检测空间学习记忆能力，跳台实验属于被动逃避条件反射，主要反映动物非空间学习记忆能力的改变。在经历电击之前的适应期训练中，潜伏期没有明显变化，说明磁刺激并未显著影响小鼠的运动能力。犯错误次数是小鼠被电击的次数，反映了短期学习记忆能力，对照组没有表现出显著的差异，表明小鼠的非空间短期学习记忆能力在老化过程中未受到显著影响。在这个过程中老年小鼠的跳台停留时间百分比明显降低，说明老年小鼠从受到电击到再次回到圆台之间的时间间隔较长。被动逃避潜伏期反映小鼠长期学习记忆能力，由于小鼠对足底电击形成了恐惧记忆，所以在被动逃避潜伏期的测试中小鼠并没有很快跳下圆台，且对照组中老年小鼠的被动逃避潜伏期显著降低，表明小鼠在老化过程中的非空间长期学习记忆能力有所减退。在高频重复经颅磁刺激的神经调控作用之下，小鼠的非空间学习记忆能力均得到了明显改善。
2.3 脑片膜片钳
如图 7a 所示，对静息膜电位的分析表明，年龄（F(2, 30) = 3.854，P < 0.05）与治疗方式（F(1, 30) = 22.04，P < 0.001）均表现出了显著的主因素效应，主因素间表现出了显著的交互效应（F(2, 30) = 26.69，P < 0.001）。事后分析结果表明，老年对照组的静息膜电位显著低于青年对照组和成年对照组，老年刺激组的静息膜电位显著高于老年对照组。
图7
膜电位及动作电位相关电特性数据分析
a. 静息膜电位；b. 动作电位发放个数；c. 后超极化电位；d. 动作电位峰值；e. 动作电位达峰时间；f. 动作电位上升支平均斜率；g. 动作电位下降支平均斜率。*
a. resting membrane potential; b. the number of APs released; c. after-hyperpolarizing potential; d. AP peak amplitude; e. time to AP peak amplitude; f. average rise slope of AP; g. average down slope of AP. *
如图 7b 所示，对动作电位个数的分析表明，年龄（F(2, 30) = 13.62，P < 0.001）与治疗方式（F(1, 30) = 16.25，P < 0.001）均表现出了显著的主因素效应，主因素间表现出了显著的交互效应（F(2, 30) = 5.027，P < 0.05）。事后分析结果表明，老年对照组的动作电位个数显著少于青年对照组和成年对照组，老年刺激组的动作电位个数显著多于老年对照组。
如图 7c 所示，对后超极化电位的分析表明，年龄（F(2, 30) = 5.806，P < 0.01）与治疗方式（F(1, 30) = 9.13，P < 0.01）均表现出了显著的主因素效应，主因素间表现出了显著的交互效应（F(2, 30) = 5.197，P < 0.05）。事后分析结果表明，老年对照组的后超极化电位显著低于青年对照组，老年刺激组的后超极化电位显著高于老年对照组。
如图 7d 所示，对动作电位峰值的分析表明，年龄（F(2, 30) = 0.077，P = 0.926）与治疗方式（F(1, 30) = 0.076，P = 0.784）均没有表现出显著的主因素效应，也没有表现出主因素之间显著的交互效应（F(2, 30) = 0.611，P = 0.549）。
如图 7e 所示，对动作电位达峰时间的分析表明，年龄（F(2, 30) = 4.985，P < 0.05）与治疗方式（F(1, 30) = 9.685，P < 0.01）均表现出了显著的主因素效应，主因素间表现出了显著的交互效应（F(2, 30) = 5.212，P < 0.05）。事后分析结果表明，老年对照组的达峰时间显著长于青年对照组和成年对照组，老年刺激组的达峰时间显著少于老年对照组。
如图 7f 所示，对动作电位上升支平均斜率的分析表明，年龄（F(2，30)= 12.67，P < 0.001）与治疗方式（F(1, 30) = 4.251，P < 0.05）表现出了显著的主因素效应，主因素之间表现出了显著的交互效应（F(2, 30) = 8.008，P < 0.01）。事后分析结果表明，老年对照组的上升支平均斜率显著低于青年对照组和成年对照组，老年刺激组的上升支平均斜率显著高于老年对照组。
如图 7g 所示，对动作电位下降支平均斜率的分析表明，年龄（F(2, 30) = 20.69，P < 0.001）与治疗方式（F(1, 30) = 5.407，P < 0.05）表现出了显著的主因素效应，主因素之间表现出了显著的交互效应（F(2, 30) = 11.06，P < 0.001）。事后分析结果表明，老年对照组下降支平均斜率的绝对值显著低于青年对照组和成年对照组，老年刺激组的下降支平均斜率的绝对值显著高于老年对照组。
通过对膜电位及动作电位相关数据的分析可得出，几乎所有的指标在整体上都呈现出相似的变化趋势，即随着自然老化过程的发生，神经兴奋性相关指标逐渐衰退，且在高频重复经颅磁刺激的调控下有所改善，特别是对老年个体相关指标的提高尤为显著。从具体特征分析来看，老年小鼠的静息膜电位相比于青年成年小鼠显著超极化，后超极化电位幅度显著增加，暗示老年小鼠神经元在静息状态下的神经兴奋性更低，在相同的刺激下使其去极化产生神经放电更难。同样地，老年小鼠神经元的后超极化电位幅度显著增加，使其神经元放电后回到了一个更低的兴奋性水平，其再次兴奋产生神经放电的能力相对更弱。动作电位达峰时间（从刺激起点至达到峰值的时间）与经线性拟合得到的上升支平均斜率的变化趋势是一致的，时间越短说明相关离子通道的开闭速率越快，膜电位去极化的过程越迅速，上升支斜率越大。下降支斜率越大，说明复极化的过程越迅速。由此在相同的时间内，神经元的放电频率越高。
3 讨论
本文旨在探究在自然老化过程中，重复经颅磁刺激对昆明小鼠认知能力与神经兴奋性的影响，并且提出了假设：老化引起的学习记忆功能的衰退可能与海马齿状回颗粒神经元相关电特性的衰退有关，如静息膜电位、后超极化电位、动作电位放电频数、动作电位峰值等，且重复经颅磁刺激可能是通过改善海马齿状回神经兴奋性从而改善认知能力。实验结果表明，昆明小鼠在老化过程中，伴随着认知功能与齿状回颗粒神经元相关电特性的退化，重复经颅磁刺激能显著改善老年小鼠的这一退化现象，但对健康的青年与成年个体影响较小。这些结果与相关文献的论述亦不冲突[24]。
基于啮齿类动物对新事物自主探索的天性，新物体识别测试被用来获取与空间记忆相关的信息[25]。这种类型的测试可以用来研究海马在空间和工作记忆水平甚至是在认知形成过程中的功能[26]。本研究进行了短期与长期的学习记忆和空间探索能力的测试，结果显示老化伴随认知衰退，而高频重复经颅磁刺激可以显著缓解老年小鼠的这一认知损伤。已有相关研究表明，高频重复经颅磁刺激可以显著提高睡眠剥夺八齿鼠在新物体识别任务中的认知指数与空间记忆[25]。从实验设计的改进方面考虑，新的空间位置的识别在这一任务中是很重要的[25]，通过接触两个物体的总时间来分析动物的运动能力也是必要的[27]。
基于被动逃避潜伏期的测量，发展了跳台的测试方法用以分析小鼠的学习记忆能力[28]，且跳台测试现已被应用于神经退行性疾病（如健忘症）中认知能力的研究[29]。本研究的结果显示：老化伴随认知衰退，高频重复经颅磁刺激可以显著缓解老年小鼠的这一认知损伤；在小鼠没有接受足底电刺激之前，跳台潜伏期没有显著差异，说明本研究采用的高频重复经颅磁刺激并未对小鼠的运动能力造成影响；对照组小鼠犯错误次数逐渐增多的趋势与跳台停留时间百分比显著降低的趋势相辅相成。有研究报道高频重复经颅磁刺激可以显著提高老年昆明小鼠在跳台被动逃避任务中的表现[30]，这与本研究的结果高度吻合。
在对动作电位相关电特性指标的分析中，磁刺激的作用可以显著缩短老年刺激小鼠动作电位达到峰值的时间，并且显著提高动作电位上升支/下降支的平均斜率，可以推测老化降低了神经元离子通道的活性，而磁刺激的作用使得离子通道的开放与关闭更加活跃。已有文献报道[17]，老年小鼠的静息膜电位相比于成年小鼠显著超极化，动作电位放电频率显著降低，后超极化电位幅度显著增加，25 Hz 的高频重复经颅磁刺激可以显著提高老年小鼠的这些神经兴奋性指标，这些发现与本研究结果高度相似。
高频重复经颅磁刺激是一种间接非侵入性的无创脑刺激技术，通过线圈产生磁场穿透颅骨，进而诱导大脑神经兴奋性产生变化[3]。在我们的研究中采用了标准的“8”字型线圈，其尺寸大于小鼠头部。因现有技术的局限性，目前无法做到对小鼠特定脑区的单一精准刺激，因此这种刺激方式是一种全脑刺激。在全脑刺激的前提下，我们研究了海马齿状回颗粒神经元兴奋性的变化，实验结果分析证明这种刺激方式是有效的。通过对比其他人员的研究，类似的全脑刺激模式是普遍被采用的[17-18, 31]，因此通过我们采用的刺激方式得到的实验结果是可靠的。虽然高频重复经颅磁刺激在本研究中显示出了积极的作用，但是本研究采用的参数设置并不能盲目应用于临床治疗。到目前为止，关于磁刺激的科学研究与临床应用，尚无统一制定的参数标准，其治疗效果也并不稳定。因此，继续探索磁刺激作用的神经机制，持续优化刺激方案，仍然是探究重复经颅磁刺激在改善认知功能方面的研究重点。
4 结论
自然老化引起的昆明小鼠认知能力的衰退与海马齿状回颗粒神经元相关电特性的衰退有关，高频重复经颅磁刺激可以缓解认知损伤与神经元相关电特性的衰退，在老年个体中的缓解作用尤为显著。通过改变海马齿状回颗粒神经元电生理特性以及提高神经元兴奋性，可能是重复经颅磁刺激缓解认知损伤、提高认知能力的机制之一。
利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。
