连续血糖监测对于重症糖尿病患者至关重要，但目前仍然没有可供临床使用的长效植入式葡萄糖传感器面世。本文介绍了连续血糖监测用传感器分类，重点探讨了传感器植入后的失效机制，指出了提高传感器植入寿命的途径及注意事项，并展望了植入式葡萄糖传感器的未来研究方向。
引用本文： 余江渊, 李崭虹, 陈诚, 陈云霞, 朱志刚. 血糖监测用植入式传感器的研究进展. 生物医学工程学杂志, 2016, 33(5): 991-997. doi: 10.7507/1001-5515.20160159 复制
0 引言
糖尿病患者目前主要采用第2代手持式血糖仪进行个人检测，Ⅱ型糖尿患者每天至少需要检测2次，Ⅰ型糖尿患者每天需要检测4次，来判断血糖的波动趋势。这种方式相对简便、廉价，但无法掌控血糖波动变化趋势及规律，特别是不可预测由低血糖昏迷导致的患者死亡。国际学术界普遍认为：对糖尿病患者血糖浓度进行连续监测是最佳诊疗方式，特别适合重症糖尿病患者。因此，人们期待一种血糖检测性能稳定且能够连续工作一个月以上的植入式葡萄糖传感器，并能在血糖浓度超过限值时进行警报，从而有助于医生指导临床用药，控制病情。理想情况下，连续血糖监测(continuous glucose monitoring，CGM)设备与胰岛素输送泵联用，构建闭合回路系统(closed loop)，也就是所谓的人工胰脏，可以模仿胰脏功能来定量输出胰岛素，从而控制血糖浓度的波动[1-2]。本文围绕连续血糖监测用传感器，首先介绍传感器发展的现状，然后探讨传感器植入体内后的失效机制，再指出提高传感器寿命的几种途径，以及制备过程中的几个注意事项，最终对全文进行小结并提出展望。
1 血糖连续监测用传感器的分类
血糖连续监测用传感器可根据技术方法和侵袭程度来分类。其中，技术方法可以分为电化学法[3]、微透析[4]和无创近红外技术[5]等；根据伤害方式分为侵入式和非侵入式；根据侵入程度，又分为微创型和全植入型。市面上的多数植入血糖仪都属于微创型，即将细针状传感器探头直接刺入皮下，基座和数据部分固定在皮肤上。电化学葡萄糖传感器因其具有检测精度高、选择特异性好、寿命长、体积小与成本低等优点，目前在连续血糖监测传感器的市场份额上遥遥领先于其他类型的传感器。而全植入式传感器，将整个系统设计成密封式，包括电源、控制电路、无线通讯数据传输、用户界面、数据库等部分，其中用户界面和数据库是体外部分，它接收传感器数据并转换成相应的血糖信号，是使用者与系统交流的媒介。由于技术上的原因，目前市面上还未出现全植入式动态血糖监测产品。
2001年美国加州Cygnus公司推出曾经轰动一时的GlucoWatch无创血糖监测产品后，新技术方法和新产品不断涌现，其主要方法包括：①电化学；②基于微渗透技术的检测，如提取汗液、唾液等；③基于红外或拉曼等光谱学研究。2014年以色列盈通格利有限公司全球首次推出糖无忌(GlucoTrack)不扎手指无创血糖仪新技术，通过无痛无创的“夹耳朵”方式监测血糖，而且可以实现多次重复检测。GlucoTrack同时采用了超声(检测声波穿过耳垂的速度)、电学(电导率变化)和热量(组织的热传输行为)三种检测方法，以提高测量准确性。如表 1所示，列举并比较了全球几种商品化连续葡萄糖检测仪器的性能。
表1
几种商品化连续葡萄糖检测仪器的比较
Table1.
Comparison of several commercially available continuous glucose monitoring devices
尽管无创血糖监测研究非常热门，但作者认为最有发展与应用前景的血糖连续监测方法是基于电化学原理的皮下植入式微创型葡萄糖传感器。这是因为此类传感器体积小，且酶对葡萄糖具有高选择性和灵敏度，也是目前使用最广泛、商品化最成熟的方法[6]。如表 1所示，多款产品已经被美国食品药品监督管理局(food and drug administration, FDA)认证，并且在医院有着广泛应用。基于电化学的植入式传感器的检测原理同体外检测基本一致，其测试原理已经历了三代传感器类型的发展[7]，主要作用机制如图 1所示。目前，植入式传感器的最大瓶颈是传感器的使用寿命只有3~5天，这是因为传感器植入机体组织后，会受到多种机制影响而失效，具体解释见下一章节。因此，制备高效长寿命的传感器是连续血糖监测的关键环节。
图1
三代葡萄糖传感器的电子传递机制示意图
Figure1.
Schematic diagram of electron transfer mechanisms with three generation enzymatic glucose biosensors
2 植入式葡萄糖传感器的失效机制
传感器植入体内后的失效机制主要有如下几种可能：①体内的异物反应(foreign body reaction, FBR)导致传感器失效，是植入后面临的最主要难题；②细胞外基质的蛋白酶渗透到器件中以及反应产物过氧化氢的聚集导致固定酶失效；③固定酶分子随着环境变化导致酶蛋白质结构变异，分子识别功能丧失；④膜的性质随着时间、温度而变化，如膜密度的变化可以改变分析物、产物以及媒介体的输运性质；⑤材料与器件故障，如膜的脱落、引线连接的断裂等。
传感器在植入之后首先在伤口引起炎症反应，随后是传感器与蛋白质、细胞以及组织之间长期交互作用容易造成异物反应。如图 2所示，任何植入的医疗器械装置都会扰乱宿主介质，损坏毛细血管并产生免疫应答。异物反应主要过程如下：①形成一个临时基质(数分钟到数小时)；②急性炎症反应(数天)；③慢性炎症反应(数周)；④肉芽组织的形成(数周)；⑤纤维包膜的形成(数周到数月)[8]。
图2
异物反应过程示意图
Figure2.
Schematic diagram of the foreign body reaction
在植入过程的早期，形成的临时基质随着血液/材料交互作用和蛋白质黏附形成周围异物，并提供结构、生物化学以及细胞成分来与身体形成异物反应。来自临时基质中的化学引诱物、细胞因子、生长因子以及其它生物活性剂除了调节巨噬细胞的表型外，还可以提高细胞的增殖与活化。因此，临时基质被认为是一种天然的衍生膜，通过释放生物活性剂来控制炎症反应的后续阶段[9]。在此阶段，生物分子与传感器膜层的黏附通常导致传感器对葡萄糖的响应下降幅度超过50%。使用质谱蛋白质组学分析生物分子附着在植入传感器的动物实验结果表明：炎症细胞和较大蛋白质分子的片段都渗入到传感器膜层并导致葡萄糖扩散能力的下降[10]。
急性炎症反应的生物作用是吞噬异物，巨噬细胞消化植入物的过程会影响体内传感器的性能。Klueh等[11-12]的结果证实巨噬细胞在体内与体外扮演着葡萄糖与氧气之间扩散代谢障碍的角色，并因此对连续血糖监测具有重要影响。
紧随急性炎症之后，由于巨噬细胞、单核细胞和淋巴细胞以及血管的增殖和结缔组织的存在，植入部位进入到慢性炎症阶段。该过程开始阻止巨噬细胞长大使得巨噬细胞融合形成异物巨细胞(foreign body giant cells，FBGCs)，企图进一步消耗/降解植入异物。这种结果会导致分析底物的扩散以及局部组织相对浓度的降低。另外巨噬细胞可消耗氧和葡萄糖产生的超氧化物和过氧化氢，影响到电化学传感器的响应。在免疫反应的最后步骤中，胶原蛋白在植入异物周围的相互作用下形成纤维包膜，使得传感器完全从局部组织环境中隔离，因此限制了葡萄糖的扩散，从而使得该传感器不能测量或报告宿主的实际血糖水平。总之，在设计植入式葡萄糖传感器时，复杂的免疫反应以及各个阶段的异物反应都应该被考虑进去，从而提高葡萄糖传感器的性能。
3 提高传感器植入寿命的途径
当传感器植入组织后会形成一个组织-传感器界面，这个界面的相容性对于传感器的正常稳定工作起到决定性作用。这个界面反应较为复杂，可分为初期、中期和后期三个阶段。因此，如何优化电极-组织生物界面已成为了一个最具挑战的问题，同时也是提高植入式传感器寿命的关键步骤。提高人体组织与传感器的界面相容性有以下几种主要途径：①传感器的微纳设计；②生物相容性膜设计与合成；③添加适当的缓释药物。
3.1 传感器的微纳设计
为了减少异物反应，现行的设计方法将传感器与相关的电子和通讯硬件分开，硬件系统被置于体外，而传感器则置于皮下、静脉或通过肌注方式植入等。其中皮下组织被认为是植入最为合适的部位，因为该部位便于进行外科手术以及传感器的更换。此外，为了最大限度地减少传感器植入时所引起的创伤及大量出血，植入式传感器的尺寸不宜太大。为限制和缓解植入后炎症反应，目前主流的传感器都沿用此类设计方法，因而传感器通常被设计成针形[13](如图 3所示)、多针、针列、线圈型等。
图3
针形植入式葡萄糖传感器示意图
Figure3.
Schematic diagram of needle-type implantable glucose biosensor
典型的针式电极具有电极植入方式灵活、各种膜层容易涂覆、组织反应程度小等优点而被广泛采用。通常采用两电极结构，即以导电的铂丝、金丝、碳化纤维作为工作电极，Ag/AgCl作为参比电极。此外，可以采用平面微电极和微电极阵列来代替针式电极，也可以通过丝网印刷和喷墨印刷碳胶制作工作电极。螺旋型铂铱合金电极最早由美国Moussy教授提出，采用螺旋型铂铱合金电极来担载葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD)，与上述针式结构相比，该器型螺旋孔道结构可以担载更多酶，从而能延长器件植入后的使用寿命。作者随Moussy教授工作多年，本课题组也一直从事植入葡萄糖传感器的深度开发，包括螺旋铂-铱电极(如图 4所示)[14]、碳纳米管(carbon nanotube，CNT)纤维电极[15]和CNT阵列与纳米Ni复合无酶电极[16]，并制备出一套基于Zigbee模块的小型连续血糖监测系统[17]。此外，植入器件时，应当避免出现尖角和边缘，由于体内存在大量的移动微组织，一旦有锋利的尖角和边缘存在，会成为炎症反应的刺激点从而加剧炎症反应，导致传感器的失效[18-19]。
图4
螺旋电极示意图
1：特氟龙包覆的Pt-Ir丝；2：Ag/AgCl丝；3：封装膜；4：Epoxy-PU半透膜；5：GOD；6：去包覆的Pt-Ir线圈；7：纤维材料
Figure4. Schematic diagram of spiral-type Pt-Ir electrode1: PTFE coated Pt-Ir wire; 2: Ag/AgCl wire; 3: sealing membrane; 4: Epoxy-PU semi-permeable membrane; 5: glucose oxidase; 6: Pt-Ir coil; 7: fiber materials
3.2 生物相容性膜材料
为了满足体内植入的苛刻要求，最常见的方法是将传感器的生物相容性薄膜制成与主体类似的仿生结构。聚合物的涂覆有利于缓解炎症反应，并具有以下几个特点：①阻止氧化酶的流失，并可以选择性地过滤干扰分子；②限制葡萄糖的渗透量，改善电极对氧的依赖性，提高传感器的检测线性范围；③此膜直接与皮下组织相接触，可通过结构设计和调制来提高生物相容性。在众多的聚合物材料中，Nafion、聚氨酯(polyurethane，PU)以及各种复合水凝胶已成功地运用到植入传感器中。
Nafion是一种全氟磺酸系聚合物，Moussy等[20]通过将包覆Nafion涂层的连续血糖监测探头植入到犬科动物，可以使传感器正常工作10天，使用后膜有着明显的开裂从而导致了传感器的失效。Chen等[21]研制出多孔聚偏氟乙烯和纳米球型Nafion复合涂层，该涂层构建的传感器植入到小鼠后，具有快速、线性地血糖浓度变化响应，并表现出与周围组织良好的生物相容性。
聚氨酯广泛地应用于生物传感器外层膜，作为与主体组织周围相容的膜材料。王宁等[22]报道了一种用于微型植入式葡萄糖传感器的多孔聚氨酯膜。该静电涂层取代了传统的环氧聚氨酯外涂层，主要充当传质限制膜并显著地提高了检测线性度，此外，该涂层具有可控的纤维多孔结构和厚度。Wang等[23]采用静电纺丝技术制备出具有多孔结构的聚亚安酯纤维膜，并探讨了分级多孔结构的尺寸效应对渗透性和表面性的影响。相比于传统的成膜工艺，静电纺丝可制备出高比例的孔隙、广泛互联的孔道、并具有良好的可裁剪性，可应用于生物传感器表面涂层。
目前，最受研究者关注的生物膜材料是水凝胶。水凝胶是由水溶性高分子与水形成三维网络结构，具有多孔、亲水等特点，是一种高吸水性材料。当在生理环境中，水凝胶可以缓解蛋白质吸附和纤维包膜。因此，水凝胶被认为是制备植入式葡萄糖传感器的重要生物膜材料。Yu等[24]讨论了水凝胶膜在植入式葡萄糖传感器的作用，该研究表明，涂覆水凝胶的传感器都可以正常工作21天以上，组织学研究表明其寿命的延长归因于水凝胶的涂覆减少了纤维包膜。Lin等[25]研究了一种新型的葡萄糖敏感水凝胶(glucose-sensitive hydrogel，GSH)，发现此凝胶涂覆后体系具有更快的反应动力学并明显减少了果糖的干扰，非常适合应用于体内葡萄糖传感器监测。Wang等[26]制备了一种用聚(乳酸-乙醇酸)[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]共聚物微球分散于聚(乙烯醇)[poly(vinyl alcohol)，PVA]的水凝胶，这种新型聚合物涂层涂覆在传感器外围，可作为一种“智能”药物释放系统直接在植入位点释放，从而缓解异物反应，进而提升体内传感器性能。
3.3 适当的添加缓释药物
急性炎症反应和随后的纤维包膜会减弱酶底物和氧气传递到传感器电极的通量，从而导致了传感器的失效。因此，引入合适的药物缓释涂层可以防止局部组织发炎，并增加毛细血管的生成。缓释药物包括抗炎药物(地塞米松，dexamethasone，DX)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和抗凝剂(肝素)。
糖皮质激素类药物DX同时具有抗炎性和免疫抑制作用，在植入后可以抑制炎症反应，将组织伤害降到最小化，使得正常组织再生，从而限制纤维包膜形成。通常水凝胶与微球的药物递送组合被认为是用作可植入式传感器生物相容涂层的最佳手段，可以最大限度减少异物反应。Wang等[27]探讨了DX加载PLGA微球/PVA复合水凝胶对传感器的影响。结果表明：该复合涂层不会影响传感器的线性范围，反而使得线性范围远超过人体生理血糖浓度范围(2~22 mmol/L)，因此可以用作植入葡萄糖传感器的智能涂层，以提高传感器在体内的存活寿命。随后，Vaddiraju等[28]在此基础上，通过在工作电极的电化学表面重建产生一个三维纳米多孔结构，来增加其电化学工作面积，成功研制了在灵敏度和大信噪比方面增强的传感器。Vallejo-heligon等[29]设计了一种具有多孔、DX释放PU涂层的葡萄糖传感器，动物研究表明，DX释放的多孔PU膜植入大鼠皮下组织可明显缓解初始炎症反应。综上，可以认为DX的释放是一种有效改善葡萄糖传感器性能的方法。尽管糖皮质激素作用的确切机制尚不清楚，但是，从植入后活性释放的DX研究表明，DX的添加可以明显减少炎症反应。
VEGF作为促进组织血管生成的释放试剂被广泛研究。除抑制炎症反应，它的主要功用是促进植入部位的新血管生成、缓解纤维包膜，从而提高传感器寿命。Kastellorzios等[30]针对DX、VEGF、血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)等三种机体组织的反应调节剂在递送过程中的协同作用进行了系统的研究。实验发现：三种反应调节剂的协同作用下可以最大限度促进血管生成、生长，并抑制炎症反应；此外，VEGF调节剂的用量应高于PDGF的剂量，增加DX的用量同时需要增加VEGF的使用量。
4 植入传感器的注意事项
4.1 生物分子的干扰
生物分子干扰物分为外源性和内源性分子。内源性分子(指人体内原本就存在的分子)干扰物包括：尿酸(uric acid，UA)、抗坏血酸(ascorbic acid，AA)、多巴胺(dopamine，DA)等。外源(指任意药物或食物中所含的活性分子)干扰物有对乙酰氨基酚(acetaminophen，AP)等。这些干扰物都具有电化学活性，在工作电极上施加较高的氧化电位时，同样会将这类干扰物氧化，从而影响测量的准确性。目前，消除这些干扰物最常用的方法是在传感器上使用一层选择性膜。这些膜通常根据尺寸大小、电荷以及极性来筛选调节各个参与反应的分子和离子的扩散通量，从而有效限制干扰分子进入。电聚合膜如聚邻苯二胺、多酚和聚氨基苯酚已经证实对减少干扰物影响非常有效，可以明显改善选择性和线性检测范围。电聚合膜的另一个优点是薄且均匀，可以被选择性地沉积到具有复杂几何形状的微电极上[31]。此外，通过对电极进行改性，例如纳米材料的应用，可明显降低传感器的工作电位，是有效减少生物体中电活性干扰物影响的重要途径。
4.2 氧气的依赖
电化学检测过氧化氢，需要氧气作为辅助物参与到酶促反应。在间质液中氧气浓度大约为葡萄糖溶液中浓度的十分之一。因此很容易出现“氧缺乏”状态，使得基于氧化酶的葡萄糖传感器在葡萄糖高浓度区失去线性度。一般情况下，当植入部位处于麻醉状态时，皮下氧分压范围为40~130 mm Hg。为减少氧气依赖，提高传感器的线性度，可以采用以下2种方法：①采用扩散限制层，如聚氨酯或聚碳酸酯。它可以改变葡萄糖和氧气的通量并增加氧/葡萄糖透过率的比值，从而减少氧依赖性并提高生物传感器的上限。例如，Zhang等[32]报道，在电极外层浸涂3％的聚氨酯溶液使得传感器线性范围上限提高到25 mmol/L。②提高氧传质速率。Gough等[33]通过在一个二维圆筒电极侧壁涂覆聚二甲基硅氧烷来减少葡萄糖流量，通过高效渗透氧气方法解决氧缺乏。对于植入式传感器而言，必须做到氧气分压在20 mm Hg时才可以正常工作。
4.3 一氧化氮的作用
一氧化氮(nitrogen oxide, NO)是一种强效的抗血栓和抗炎剂，早在20世纪80年代，就被发现是一种血管内皮衍生松弛因子，可以控制放松和平滑肌细胞衬脉管收缩。研究表明，NO在血管生成、癌症生物学和骨重塑等领域发挥着重要作用。治疗性材料如能可控地释放NO，则可以促进植入物的生物相容性，但是NO有效递送效率低被认为是限制NO靶向治疗的重要瓶颈。Soto等[34]在针式电极上涂覆含有NO释放物的聚氨酯膜层，经NO缓释的传感器可以明显改善传感器植入1~3天后的精度，同时延迟响应时间减少到4.2 min。Koh等[13]将NO供体加载纤维修饰到多孔聚氨酯膜包覆的针型植入式传感器中，当这些多孔纤维膜厚度≤50 μm时，不会影响生物传感器的性能。尽管这些研究强调NO释放物可以改善FBR反应，但毕竟处在早期研究阶段，其机制尚未完全阐释，需要更深入细致地研究。
5 小结与展望
连续血糖监测用植入式传感器的发展包括生物相容性膜的开发、表面改性[35]和电极微型化几个方面，提高植入传感器的分析灵敏度和精度、减少身体异物反应并最终延长器件寿命是一项极富挑战的工作。虽然上文所叙的一些方法，已经被采用且被证实是非常有效的，但高效长寿命的植入式传感器件至今仍不完善。因此，在今后的研究工作可以密切关注以下问题：①酶的稳定性：酶的稳定性在植入式生物传感器中至关重要，直接决定了信号的重现性和分析性能。酶的稳定性主要受固定酶的方法和微环境的影响。Harris等[36]总结了过氧化氢、小分子材料(抗坏血酸盐、尿素盐、半胱氨酸等)的聚集和戊二醛交联三者对氧化酶降解的影响，指出葡萄糖氧化酶基因改性并辅之以硅凝胶封装是一条提高植入传感器寿命有效的办法。②生物分子的干扰：通过涂覆选择性半透膜来减少内源性分子(UA、AA、DA)和外源性分子(AP)等电化学活性物质的干扰。此外，通过传感器电极设计，将工作电位降低、甚至到负电位，可以有效缓解干扰物的影响。③氧气的含量：电化学检测过氧化氢，需要氧气作为辅助参与到酶促反应。在间质液中氧气浓度大约为葡萄糖溶液浓度的十分之一，而导致出现“氧缺乏”状态，需要通过增加外层扩散限制膜、电聚合物[37]或者电子媒介体来缓解。④生物相容性膜材料：通过构建新型复合水凝胶，比如内层采用静电逐层自组装技术(layer-by-layer，LBL)来沉积高分子电解质，改善膜表面电性，从而缓解带电蛋白质的表面淤积。为了减少纤维包膜的形成，外层可以采用共聚物水凝胶，通过物理及化学胶凝方式来形成网络互穿结构，打破纤维形成的连续包膜。通过此复合结构涂层来同时缓解电极表面的蛋白质淤积和纤维包膜的形成，从而缓解异物反应。
