大脑老化会影响脑区之间的功能连接（FC），近几年有研究表明脑区之间的功能连接是随着时间变化的，而这种动态的变化能反映更多的生理病理信息。因此，本研究基于静息态功能磁共振成像（fMRI），采用滑动窗技术构建了 32 名老年受试者和 36 名年轻受试者的动态功能连接网络。利用小波包分析研究了波动能量差异对频段的依赖性，并与年龄进行线性回归分析。本文研究结果发现，老年组的功能连接波动能量在低频段高于青年组，而在高频段低于青年组。结果表明，老年人网络间的动态功能连接存在慢波化现象，这可能与老年人大脑的功能衰退有关。通过本文研究结果，可为脑老化的研究提供一种新的思路，同时也可促进对动态功能连接的理解。
引言
脑老化表现为一定程度的认知功能减退，已有的研究表明，大脑认知功能衰退与不同脑区之间功能连接（functional connectivity，FC）的改变有关[1-2]。利用静息态血氧水平依赖（blood oxygenation level dependent，BOLD）的功能磁共振成像（functional magnetic resonance imaging，fMRI）技术开展的相关研究表明，年龄相关的 FC 衰减优先影响默认模式网络和背侧注意网络，现已认为这些网络与注意、记忆及执行功能等存在关联[3]。另外，其他网络，如突显和运动网络也存在与年龄相关的衰减现象[4]。在大部分基于老年人群静息态 fMRI 数据的研究中，更多关注的是 FC 衰减现象，但是也有研究发现，存在与年龄相关的 FC 增强现象[5]。
大部分关于 fMRI 的研究都假设：大脑信号之间的关联关系在采集时间上是恒定的，基于此假设得到了很多有价值的研究，但是这些研究在某种程度上有一定的局限性，因为近几年的研究表明，静息态下脑区之间的 FC 是动态变化的[6-8]。研究已证明，FC 的动态变化是有生理意义的，可以用于揭示大脑认知功能变化的规律。在静息态时，随着年龄的增长，大脑的各种神经活动及脑区之间信息的传递、交流会发生改变。考虑到脑老化对大脑稳态 FC 的影响以及 FC 随时间波动的现象，本文提出这样的假设：脑老化可能影响静息态下动态 FC 的特征。因此，本文将从大脑动态 FC 频域角度出发，采用基于小波包分析的方法提取能量特征，对比不同年龄阶段受试者 FC 波动不同子频段的差异性，探讨大脑正常衰老进程中 FC 网络动态特性的变化规律。总之，本研究意在通过研究基于静息态 fMRI 的动态 FC 特性，分析大脑正常衰老进程中功能网络间 FC 特性的变化规律，尝试揭示大脑衰老进程中认知功能改变的内在过程，这对深入认识大脑的老化机制以及了解大脑老化过程中生理、病理变化有重要的科研意义。
1 实验数据
1.1 受试者选择
本研究所用的静息态 fMRI 的数据来源于内森克莱研究中心发布的网上公开数据库（Nathan Kline Institute-Rockland sample，NKI-RS），网址为：。
数据分为两组：年轻组选取受试者 36 名，男、女比例为 24/12，年龄为（22.1±1.5）岁；老年组选取受试者 32 名，男、女比例为 15/17，年龄为（70.6±7.3）岁。分组与筛选除了年龄差异具有统计学意义以外，性别、惯用手等差异均无统计学意义。NKI-RS 数据的采集得到了相关机构审查委员会的批准，受试者均签署了书面同意书，数据可用于科学研究。
1.2 数据采集参数
采用西门子 3.0T Trio Tim 磁共振仪采集。扫描参数为：重复时间（repetition time，TR）/回波时间（echo time，TE）=2 500/30 ms，翻转角（flip angle，FA）=80°，视野（field of view，FOV）=216×216 mm2，分辨率 3×3×3 mm3，矩阵=64×64，轴向层数为 38，扫描时间为 650 s，共 260 个时间点。
T1（T1 加权）数据用于解剖定位和空间配准，采集参数为：TR/TE=2 500/3.5 ms，FA=8°，FOV=256×256 mm2，分辨率 1×1×1 mm3，轴向层数为 192。在采集过程中受试者无需做任务，只需要保持闭眼，放松状态即可。
2 数据处理及方法
2.1 预处理及网络构建
采用功能连接体计算系统（connectome computation system，CCS）（）软件对功能图像进行预处理[9]，步骤主要包括：去除前 4 个时间点、时间层校正、三维几何位移头动校正以及基于四维（four dimensional，4D）全脑均值校正；另外，用弗里斯顿 24 参数模型（Friston-24）去除微观水平的运动伪影，回归干扰参数，参数包括：个体全脑均值信号、白质和脑脊液的均值信号；预处理过程还包括：带通滤波（0.01～0.08 Hz）、去基线漂移、空间平滑（高斯核为 6 mm）。预处理后，每个受试者的三维图像具有 256 个时间点。
本文利用滑动时间窗技术构建动态 FC 网路。首先采用 2010 年 Dosenbach 等[10]提出的 160 脑区模板，定义了 142 个脑区（去除小脑）作为节点。感兴趣区（regions of interest，ROIs）是以蒙特利尔神经学研究所（Montreal Neurological Institute，MNI）坐标系统为原点，画的半径为 5 mm 的球。ROIs 可以分为 5 个静息态子网络：带状盖网络（cingulo-opercular network，CON）、默认模式网络（default mode network，DMN）、额顶网络（fronto-parietal network，FP）、枕区网络（occipital network，OCC）以及感觉运动网络（sensorimotor network，SM）。然后，我们利用静息态 fMRI 数据处理软件（resting-state fMRI data analysis toolkit，REST）软件提取 ROIs 的时间序列的平均值。接下来，采用窗长 24 TR 也就是 60 s 的时间窗，滑动步长为 1 TR，构建动态 FC 网络。具体流程如图 1 所示，通过计算第i 个时间窗内时间序列的 FC 矩阵并进行费希尔 Z 变换（Fisher-Z），然后依次滑动时间窗，得到 232 个 FC 矩阵。最后，将 232 个二维矩阵向量化，得到一个二维的动态 FC 矩阵。
图1
动态功能连接矩阵构建流程图
Figure1.
Flow diagram of dynamic functional connectivity network construction
2.2 频域特征提取
静息态下大脑的 FC 是不稳定的，是不断变化的时间序列，而且已证明它不是一个随机噪声信号，具有一定的生理意义。传统的分析中计算整个扫描时间的相关性忽略了 FC 的频率信息，故本节基于动态 FC 序列，提取其频域特征。
基于傅里叶变换的频谱分析方法是应用最为广泛的用于非平稳时间序列的频率特征分析的工具。为了研究脑老化对动态 FC 频域特征的影响，首先计算年轻组和老年组的 5 个子网络的平均动态 FC，通过傅里叶变换分别计算其频谱特性，并进行组间比较，定性分析两个组之间的差异。
为了定量研究两组的频域特征差异，本文利用小波包的方法对频谱进行频段划分，然后选取归一化能量作为动态 FC 时间序列的特征参数。基于小波包分析的能量特征提取方法，利用了小波包可以将信号的频带进行多层次划分，从而提高时频分辨率的特性，对所有受试者的全脑的动态 FC 进行低频和高频分解，为信号频域分析提供了一种更加精细的分析方法。
本文研究基于小波包分析的能量特征的提取步骤如下：
（1）对每一对 FC 进行j 层小波包分解，得到小波包系数为 ；
（2）计算总的小波包能量为：
| ${E_{tot}} = \left\| {f(t{{\left. ) \right\|}^2}} \right. = \sum\limits_{i = 0}^{{2^j} - 1} {\left\| {{\rm{d}}(j,i{{\left. ) \right\|}^2}} \right.} $ |
式（1）中，j 为分解层数，i 为第j 层上的第i 个子带。选择n 个对信号能量最为敏感的若干频带，求出各频带的能量并对其进行归一化处理，即定义归一化能量为：
| ${P_i} = \frac{{{E_i}}}{{{E_{tot}}}} = \frac{{\left\| {\rm{d}} \right.(j,i{{\left. ) \right\|}^2}}}{{\sum\limits_{i = 0}^{{2^j} - 1} {\left\| {{\rm{d}}(j,i{{\left. ) \right\|}^2}} \right.} }}$ |
本文对全脑 FC 进行了 2～5 层的小波分解，计算了每一频段的归一化能量，然后对子网络内及网络间动态 FC 的平均归一化能量和全脑连接的归一化能量在各个频段进行了双样本t 检验，并进行错误发现率（false discovery rate，FDR）方法校正（P<0.05），由于将大脑分为 142 个脑区，脑区之间的连接数通过公式N×（N–1）/2 计算共 10 011 对，这样就可能对上百或者上千对连接做出错误的判断。为了避免这一问题，因而采用 FDR 方法进行多重检验校正。经过预实验验证，结果显示，在 5 层小波分解得到的某些子频段的归一化能量存在差异，而其他的层数分解和子频带只有极少数连接甚至没有连接存在确定的组间差异，故本文对全脑 FC 进行 5 层的小波分解，提取归一化能量作为频域特征。
根据t 检验的结果，本文利用一元线性回归分析方法估计了差异具有统计学意义的连接的归一化能量与老年组年龄的关系，得到与年龄具有相关性的连接（P<0.05），从而可探索老化进程中动态 FC 频域特征的变化趋势。
3 实验结果
3.1 频域特征的组间差异
单个年轻受试者和老年受试者的子网络的频谱曲线如图 2 所示，FC 为一个低频信号，5 个子网络的频谱分布相似，但是存在一定的差异。比较年轻受试者与老年受试者的频谱分布发现，在相同的频段，老年受试者的幅值偏低。为了对 FC 的频谱进行定量分析，下面利用小波包的方法对频谱进行频段划分。
图2
子网络内平均功能连接的频谱图
Figure2.
Spectrogram of the average functional connectivity within sub-network
基于小波包分析的研究结果发现，在 5 层分解得到的两个较低频段（频段 1 为 0～0.006 25 Hz，频段 2 为 0.006 25～0.012 5 Hz）的差异具有统计学意义，而在其他频段的差异则没有统计学意义。两个频段的子网络的平均归一化能量t 检验结果如图 3 所示（P<0.05），图中有灰度的位置表示差异具有统计学意义的连接，灰度差异表示t 检验计算的T 值。如图 3 所示，在频段 1（0～0.006 25 Hz）内，OCC 与 CON、OCC 和 FP 网络之间存在的差异具有统计学意义，均为年轻组小于老年组，而网络内的连接差异不具有统计学意义；在频段 2（0.006 25～0.012 5 Hz）内，SM 与 CON、SM 与 DMN 网络之间的连接及子网络内的连接没有统计学差异，而在其他的网络间均为年轻组大于老年组，并且在 OCC 与 CON、OCC 和 FP 网络之间的差异更加明显。
图3
小波包分解子频段归一化能量的t 检验结果（P<0.05）
Figure3.
t test results of sub-band normalized energy based on wavelet packet decomposition（P<0.05）
为了估计是否是特殊脑区之间的 FC 显示了年龄相关的改变，对年轻组和老年组的全脑 FC 的能量特征进行了双样本t 检验（P<0.05，经 FDR 校正），如图 4 所示，左侧为t 检验的结果，右侧为差异具有统计学意义的连接三维视图，在频段 1（0～0.006 25 Hz）中，网络间绝大部分差异有统计学意义的连接为年轻组小于老年组，而在网络内，为年轻组大于老年组；在频段 2（0.006 25～0.012 5 Hz）中，网络间差异有统计学意义的连接均为年轻组大于老年组，而在网络内，差异有统计学意义的连接较少。在三维视图中，蓝色的连线表示年轻受试者的特征小于老年受试者，红色的连线表示年轻受试者的特征大于老年受试者。可以看出差异有统计学意义的连接既有大脑半球内的连接又有大脑两个半球之间的连接，而老化更容易影响半球间的 FC。另外，可以看出，相对能量有差异的连接涉及的脑区在左半球比较集中，而在右半球比较分散。
图4
双样本t 检验结果及功能连接的可视化（经 FDR 校正，P<0.05）
Figure4.
Two-samplet-test results and visualization of functional connectivity（FDR,P<0.05）
3.2 线性回归分析结果
以频段 0～0.006 25 Hz、0.006 25～0.012 5 Hz 的归一化能量这两个特征为因变量进行回归分析。两个频段的归一化能量与年龄的线性回归结果如表 1、表 2 所示。两个频段的归一化能量的直线拟合的结果如图 5 所示。在 0～0.006 25 Hz 频段，归一化能量随年龄降低的 FC 主要为 CON 与 SM 之间的连接（即，中脑岛和后脑岛之间的连接）、DMN 内的连接（即，后扣带回之间的连接）、SM 内的连接（即，后脑岛与顶叶之间的连接）；值得注意的是，归一化能量与年龄的相关性不仅仅呈负相关，在有些脑区之间的连接的归一化能量随年龄呈增加趋势，这些脑区主要为 FP 与 SM 之间的连接（即，后顶叶与顶叶之间的连接）。类似的，在 0.006 25～0.012 5 Hz 频段，归一化能量与年龄呈负相关的连接主要为 DMN 与 FP（即，楔前叶与后顶叶之间的连接）、FP 与 SM 之间的连接（即，顶下小叶与顶叶之间的连接）、SM 区内的连接（即，顶叶之间的连接）；而归一化能量与年龄呈正相关的连接即为 SM 内的连接（即，顶叶与后脑岛之间的连接）。
表1
0～0.006 25 Hz 频段的归一化能量线性回归结果（P<0.05）
Table1.
0～0.006 25 Hz band normalized energy linear regression results（P<0.05）
表2
0.006 25 Hz～0.012 5 Hz 频段的归一化能量线性回归结果（P<0.05）
Table2.
0.006 25 Hz～0.012 5 Hz band normalized energy linear regression results（P<0.05）
图5
线性回归的结果（P<0.05）
Figure5.
linear regression relationship between normalized energy and age（P<0.05）
4 讨论
近几年，基于 fMRI 的动态 FC 网络已经成为脑科学领域的研究热点。本文将不同脑区间的 FC 动态波动转到频域分析，研究了老化对大脑 FC 自发波动不同频段能量的影响。研究结果表明，FC 为一个低频振荡的时间序列，通过年轻受试者和老年受试者的组间比较发现，在不同的频段，FC 的归一化能量的差异具有统计学意义。
网络内的 FC 的归一化能量，在低频段均为年轻组大于老年组，在高频段主要为年轻组小于老年组。这表明，老年人的网络内连接的能量在向高频段转移。基于此，我们猜测可能的原因为由脑老化引起网络内神经资源的应用效率降低，从而使网络内脑区过分活跃[11-12]。然而在子网络水平上并没有发现那些差异，这可能是由于计算均值时消除了那些差异。
与网络内连接相比，进行组间比较显示的网络间连接差异更加明显。在大脑网络间 FC 波动的低频段，老年组高于年轻组；而在较高频段，老年组又低于年轻组。这表明，老年人网络间 FC 的自发波动能量有向低频段转移的现象，也出现慢波化现象。这可能与老年组功能网络间信息传输、处理和协调的能力改变有关。诸多研究表明，诸多大脑疾病或异常，如老化等，将引起大脑放电活动的慢波化[13-15]。虽然本文发现的 FC 波动慢波化与电生理的慢波化有很大差异，但是似乎功能活动的慢波化是大脑异常或者退化的一个特征。
在大脑老化的研究中，研究者发现神经元树突和棘突结构性发生改变，大脑白质中（白质完整性对于保证大脑皮层网络联系，尤其是与执行功能、知觉速度和记忆相关的脑区的网络联系具有重要作用）有髓神经纤维会大量减少[16]，这将导致神经冲动在神经元上的传导速率下降，使网络间信息交流速率变慢。这或许可以解释老年人在任务处理的过程变慢的原因，复杂的任务需要调动多个网络，可能需要花费更长的时间和更多的努力。然而，这里并没有直接的证据表明老年人动态 FC 的慢波化现象与反应速度降低之间存在联系。
总之，本研究为后续老龄化相关的 FC 变化的探索提供了新的方法和思路，同时深入地理解了动态 FC 子频段差异的生理机制，为神经科学研究提出了新的问题和思考方向。
